Paris, 27 août 2015
Imiter les virus pour livrer des médicaments au coeur des cellules

Les virus ont une aptitude à détourner le fonctionnement des cellules pour les infecter. En s'inspirant de leur mode d'action, des chercheurs du CNRS et de l'Université de Strasbourg ont conçu un « virus chimique » capable de franchir la double couche de lipides qui délimite les cellules, puis de se désagréger dans le milieu intracellulaire afin d'y libérer des molécules actives. Pour cela, ils ont utilisé deux polymères de leur conception, qui ont notamment des capacités d'auto-assemblage ou de dissociation selon les conditions. Ces travaux, fruit d'une collaboration entre chimistes, biologistes et biophysiciens, sont publiés dans l'édition du 1er septembre de la revue Angewandte Chemie International Edition.
Les progrès biotechnologiques donnent accès à un trésor de molécules ayant un potentiel thérapeutique. Beaucoup de ces molécules sont actives uniquement à l'intérieur des cellules humaines et restent inutilisables car la membrane lipidique qui délimite les cellules est une barrière qu'elles ne peuvent pas franchir. L'enjeu est donc de trouver des solutions de transfert aptes à traverser cette barrière.

En imitant la capacité des virus à pénétrer dans les cellules, des chimistes du Laboratoire de conception et application de molécules bioactives (CNRS/Université de Strasbourg) cherchent à concevoir des particules à même de libérer des macromolécules actives uniquement au sein des cellules. Pour cela, ces particules doivent obéir à plusieurs contraintes souvent contradictoires. Elles doivent être stables dans le milieu extracellulaire, capables de se lier aux cellules afin d'être internalisées mais être plus fragiles à l'intérieur des cellules pour libérer leur contenu. Avec deux polymères de leur conception, les chercheurs ont réussi à construire un "virus chimique" remplissant les conditions nécessaires pour transférer directement des protéines actives dans la cellule.

Concrètement, le premier polymère (pGi-Ni2+) sert de support aux protéines, qui s'y fixent. Le second polymère (πPEI), récemment breveté, encapsule cet ensemble grâce à ses charges positives qui se lient aux charges négatives du pGi-Ni2+. Les particules obtenues (30-40 nanomètres de diamètre) sont capables de reconnaitre la membrane entourant les cellules et de s'y lier. Cette liaison active une réponse cellulaire : la nanoparticule est enveloppée par un fragment de membrane et entre dans un compartiment intracellulaire appelé endosome. Alors qu'ils étaient stables à l'extérieur de la cellule, les assemblages sont ébranlés par l'acidité qui règne dans ce nouvel environnement. Par ailleurs, cette baisse de pH permet au polymère πPEI de faire éclater l'endosome, ce qui libère son contenu en molécules actives.

Grâce à cet assemblage, les chercheurs ont pu concentrer suffisamment de protéines actives à l'intérieur des cellules pour obtenir un effet biologique notable. Ainsi, en transférant une protéine appelée caspase 3 dans des lignées de cellules cancéreuses, ils ont réussi à induire 80 % de mort cellulaire1.

Les résultats in vitro sont encourageants, d'autant que ce "virus chimique" ne devient toxique qu'à une dose dix fois supérieure à celle utilisée dans cette étude. Par ailleurs, des résultats préliminaires chez la souris ne font pas état de surmortalité. L'élimination par l'organisme des deux polymères reste cependant une question ouverte. La prochaine étape consistera à tester ce système de manière approfondie in vivo, chez l'animal. A court terme, ce système servira d'outil de recherche pour vectoriser2 dans les cellules des protéines recombinantes et/ou chimiquement modifiées. A long terme, ce travail pourrait ouvrir le champ d'application des protéines pharmaceutiques à des cibles intracellulaires et contribuer à la mise au point de médicaments novateurs.

Ces travaux ont été rendus possibles par la collaboration de biophysiciens et de biologistes. Les compétences en cryomicroscopie électronique de l'Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (CNRS/Université de Strasbourg/Inserm) et l'expertise en microscopie à force atomique du Laboratoire de biophotonique et pharmacologie (CNRS/Université de Strasbourg) ont permis de caractériser les assemblages moléculaires de manière très précise. Le laboratoire Biotechnologie et signalisation cellulaire (CNRS/Université de Strasbourg) a quant à lui fourni les protéines recombinantes encapsulées dans le virus artificiel.

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Sclérose latérale amyotrophique

Dossier réalisé en collaboration avec Séverine Boillée (unité Inserm 1127 /université Pierre et Marie Curie, Institut du cerveau et de la moelle épinière, Paris) - décembre 2015

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie dégénérative grave et handicapante qui conduit au décès dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. L'effort de recherche qui lui a été dédiée ces dernières années a permis de développer les connaissances sur la génétique et la biologie de cette maladie. Et si aucun traitement curatif n'est encore disponible, les perspectives à moyen terme sont encourageantes.

Les motoneurones sont les cellules nerveuses de la moelle épinière qui provoquent la contraction des muscles. L'image montre en fluorescence un motoneurone de rat en culture. On distingue clairement le corps cellulaire d'un diamètre de trente microns, l'axone et les fibres collatérales. © Inserm, C. Henderson
© Inserm, C. Henderson
Les motoneurones sont les cellules nerveuses de la moelle épinière qui provoquent la contraction des muscles. L'image montre en fluorescence un motoneurone de rat en culture. On distingue clairement le corps cellulaire d'un diamètre de trente microns, l'axone et les fibres collatérales.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), aussi connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative grave qui se traduit par une paralysie progressive des muscles impliqués dans la motricité volontaire. Elle affecte également la phonation et la déglutition.

Il s'agit d'une maladie au pronostic sombre, dont l'issue est fatale après 3 à 5 ans d'évolution en moyenne. Le plus souvent, c’est l’atteinte des muscles respiratoires qui cause le décès des patients.

La SLA est due à la mort progressive des motoneurones, les cellules nerveuses qui dirigent et contrôlent les muscles volontaires. Elle touche les deux types de motoneurones effecteurs de la motricité : ceux dits centraux, localisés dans le cerveau, et ceux dits périphériques, situés dans le tronc cérébral et la moelle épinière. Ces derniers assurent le relais entre les motoneurones centraux et les muscles.

 
La composante génétique encore mal cernée

L'origine de la SLA est complexe à déterminer : la survenue de la maladie serait multifactorielle, soumise à l'influence de la génétique et de l'environnement.

Concernant le rôle de l’environnement, aucun facteur déclenchant n'a été clairement mis en évidence. Le tabac, le sport de haut niveau, les pesticides, les métaux lourds et la cyanotoxine BMAA, présente dans certaines algues, sont suspectés. Mais, à ce jour, les données disponibles ne permettent pas de les impliquer formellement.

Dans la pratique, la SLA est familiale chez 10% des malades. Dans ce cas, l'origine génétique est probable, même si elle n'est pas toujours facile à démontrer. Pendant longtemps, une seule mutation responsable de la maladie était connue. Affectant le gène SOD1, elle a permis de donner naissance au premier modèle animal de SLA. Depuis, une vingtaine d'autres gènes impliqués ont été identifiés : C9ORF72, dont la mutation est observée dans plus de 40% des formes familiales, TARDBP, FUS/TLS... Lorsque aucune mutation causale connue n'est retrouvée, la maladie familiale découle probablement de l’altération d'un ou de plusieurs gènes pour l'heure non identifiés.

Lorsque la maladie touche des personnes sans risque génétique familial (90% des cas), elle est dite sporadique. Ces cas sont vraisemblablement liés à la mutation aléatoire (et non transmise) d'un gène causal ou d'un ou plusieurs gènes de susceptibilité (qui augmenteraient le risque de survenue de la maladie).

Une maladie progressivement invalidante


Voir la vidéo de l'association ARSLA et autres maladies du motoneurone sur la sclérose latérale amyotrophique

La SLA apparaît souvent entre 50 et 70 ans, même si elle survient en moyenne plus précocement lorsqu'elle est d'origine familiale.

Elle prend des formes différentes selon la nature de l'atteinte initiale :

Dans environ 30% des cas, elle débute au niveau du tronc cérébral. On parle d'une forme à début bulbaire dont les premières manifestations sont les difficultés à articuler ou à déglutir.
Dans les autres cas, la SLA altère d'abord les motoneurones périphériques : dans cette forme à début spinal, c'est par une faiblesse et unegêne au niveau d'un bras, d'une jambe ou d'une main que se manifeste la maladie pour la première fois.
La maladie s'intensifie progressivement : des contractures, une raideur des muscles et des articulations apparaissent localement. L'atteinte se transmet à d'autres muscles. Une fonte musculaire et des troubles de la coordination finissent par gêner la marche et la préhension des objets. Les difficultés à déglutir ou à articuler croissent. L'atteinte des muscles respiratoires intervient souvent à un stade avancé de la maladie. Elle précipite son aggravation et le risque de décès.

Une meilleure connaissance de la maladie permet aujourd'hui de repérer des formes de SLA dans lesquelles apparaissent aussi des douleurs, des manifestations de type parkinsoniens ou des troubles du comportement (démence fronto-temporale).

Des mécanismes physiopathologiques variés et encore mal compris 
Il est encore très difficile d'établir précisément les mécanismes initiant et maintenant la dégénérescence neuronale impliquée dans la SLA. Cependant, plusieurs phénomènes ont été décrits, notamment grâce à l’étude des mutations génétiques associées à la maladie et de leur impact sur le fonctionnement des cellules nerveuses. Il s’agit, entre autre, de défauts de repliement des protéines mutées qui s'agrègent avec d'autres protéines dans les cellules : ces amas peuvent bloquer des fonctions vitales pour les neurones, conduisant par exemple au dysfonctionnement des mitochondries (qui produisent l‘énergie des cellules) ou à une perturbation des fonctions de transport dans le neurone. Certaines mutations (affectant les gènes TDP43, FUS, C9ORF72) peuvent aussi entraîner un défaut dans la maturation des ARN messagers, des molécules impliquées dans la synthèse des protéines nécessaires au bon fonctionnement de la cellule. Dans les neurones porteurs de mutations du gène TDP43, c'est la production même des ARN messagers qui serait perturbée.
Autre hypothèse : celle de l'excitotoxicité du glutamate (un neurotransmetteur) sur les cellules nerveuses. Ce phénomène serait lié à une stimulation continue et anormale des neurones par une trop grande production de glutamate ou par sa mauvaise élimination. Sont également pointés du doigt le stress oxydatif et l’atteinte des cellules gliales (cellules de soutien des neurones) ou des cellules immunitaires. Les modèles animaux de la SLA ont mis en évidence un état inflammatoire chronique local dans lequel les cellules microgliales, les astrocytes et les macrophages environnants jouent un rôle délétère sur les neurones. Ces mécanismes pourraient donc constituer une cible thérapeutique potentielle. Enfin certains patients présentent un hypermétabolisme qui peut engendrer une perte de poids significative et aggraver le pronostic. Certaines études visent à comprendre la corrélation entre ces deux phénomènes. Il faut désormais comprendre comment s'articulent et/ou coexistent tous ces mécanismes entre eux.

Diagnostic par élimination

Il était une fois les motoneurones - Motoneurones et axones (rouge), noyaux des cellules (bleu) dans la moelle épinière. Image réalisée lors du concours photographique organisé pour les 50 ans de l'Inserm, catégorie 1 : L'image scientifique (comme résultat de recherche). Sélection Rhônes-Alpes. © Inserm, S. Cavagna
© Inserm, S. Cavagna
Il était une fois les motoneurones Motoneurones et axones (rouge), noyaux des cellules (bleu) dans la moelle épinière. Image réalisée lors du concours photographique organisé pour les 50 ans de l'Inserm, catégorie 1 : L'image scientifique (comme résultat de recherche). Sélection Rhônes-Alpes.

Le diagnostic de la SLA est souvent posé par élimination, après avoir écarté les pathologies de présentation proche parmi les maladies neurodégénératives et celles qui touchent les motoneurones.

Ce diagnostic repose sur des examens neurologiques et cliniques. Le neurologue en charge de cette évaluation recherche la présence de signes de neurodégénérescence au niveau musculaire, de signes d'atteinte bulbaire et de pathologies ou de symptômes associés. L’examen neurologique associé à un bilan biologique, à la réalisation d'un électromyogramme et à celle d'un IRM permettent de confirmer le diagnostic face à des symptômes persistants depuis quelques mois.

L'aggravation des symptômes reste l'un des signes permettant de différencier la SLA d'autres maladies du motoneurone, mais des examens spécifiques peuvent être prescrits au cas par cas pour le confirmer.

La SLA demande une prise en charge pluridisciplinaire

Il n'existe pas de traitement curatif de la SLA. La prise en charge de la maladie cible les symptômes : aide technique, kinésithérapie et médicaments antispastiques pour contrer les troubles moteurs, myorelaxants et antalgiques contre les douleurs, prise en charge de la dénutrition, orthophonie pour les troubles de la parole et de la déglutition, accompagnement psychologique…

Même si le pronostic de la maladie reste sévère, de réels progrès ont été réalisés ces vingt dernières années :

La ventilation non invasive (VNI), qui supplée la fonction respiratoire lorsqu'elle commence à décliner,
et la prescription de riluzole, seul médicament à avoir démontré sa capacité à ralentir l'évolution des symptômes, améliorent modestement l'espérance de vie des patients SLA.
Depuis les années 1990, les personnes atteintes de SLA bénéficient d'une prise en charge optimale, spécialisée et pluridisciplinaire à travers un réseau de centres de référence : il en existe aujourd'hui une vingtaine, répartis sur toute la France.

Dissocier les différentes formes de SLA pour mieux les traiter

Depuis quelques années, on commence à considérer la SLA comme un syndrome, et non plus comme une maladie : l'âge de survenue des premiers symptômes, la présentation bulbaire ou spinale initiale, la rapidité d'évolution, ou encore les pathologies associées peuvent en effet laisser penser que différentes maladies du motoneurone seraient regroupées sous le nom générique de SLA. Cette hétérogénéité pourrait expliquer l'échec de nombreux essais cliniques conduits autour de nouveaux traitements.

Un des objectifs des chercheurs est donc de dissocier l'ensemble des patients en groupes plus homogènes ; la découverte récente de différentes mutations génétiques pourrait aider à mieux regrouper ceux pour lesquels la cause de la maladie est la même. Les symptômes cliniques peuvent aussi aider à différencier les patients, même si leur spécificité est imparfaite. De nouvelles perspectives seront apportées par l'identification de nouveaux biomarqueurs.


A la recherche de biomarqueurs pertinents

L'identification de biomarqueurs biologiques ou radiologiques pourrait non seulement faciliter ce diagnostic, mais aussi aider à prédire l'évolutivité de la SLA et la réponse aux traitements.

Plusieurs pistes sont aujourd'hui à l'étude :

Celle des neurofilaments. Ces assemblages de protéines forment le cytosquelette des neurones et peuvent s’agréger dans les motoneurones en cas de SLA. Des premières données suggèrent une corrélation entre le taux d'une sous-partie protéique des neurofilaments retrouvé dans le sang ou le liquide céphalorachidien et l'évolution de la maladie ;
Celle de protéines et d'ARN issues de certains sous-types de lymphocytes dont la quantité augmente chez les personnes atteintes de SLA. Le suivi de leur concentration sanguine pourrait être un marqueur de la vitesse d'évolution de la maladie ;
Celle de l'imagerie fonctionnelle. En permettant d'étudier la dynamique de l'activité cérébrale, elle pourrait être utile, à terme, pour prédire la progression de la maladie. Des données expérimentales montrent que l'IRM permettrait de mesurer des paramètres d’atrophie de la moelle épinière, tandis que le PET-scan pourrait lui utiliser l’évolution de l’inflammation comme marqueur prédictif.
Ces études sont encore du domaine de la recherche et il n'existe encore aucun biomarqueur validé permettant d'envisager une utilisation en clinique.

Vers de nouvelles perspectives de traitement

Motoneurones -  Caractérisation par immunomarquage de neurones moteurs issus de cellules souches embryonnaires humaines. Les neurones sont détéctés en vert par le marqueur TuJI alors que les neurones moteurs sont révélés en rouge par l'expression du transporteur vésiculaire de l'acétylcholine. Les noyaux sont révélés en bleu au Dapi. I-Stem, Génopole d'Evry. © Inserm, C. Martinat
© Inserm, C. Martinat
Motoneurones - Caractérisation par immunomarquage de neurones moteurs issus de cellules souches embryonnaires humaines. Les neurones sont détéctés en vert par le marqueur TuJI alors que les neurones moteurs sont révélés en rouge par l'expression du transporteur vésiculaire de l'acétylcholine. Les noyaux sont révélés en bleu au Dapi. I-Stem, Génopole d'Evry.

Jusqu'à présent de nombreux candidats médicaments ont échoué à montrer leur efficacité. Mais, une nouvelle vague d'innovations a récemment été portée par l'identification de gènes responsables de la SLA et par la compréhension des cascades biologiques intervenant dans la survenue de la maladie. Ainsi, chacun des mécanismes pathogènes décrits constitue une cible thérapeutique potentielle.

Plusieurs agents thérapeutiques sont étudiés pour contrer la toxicité de la protéine mutante SOD1. Des essais cliniques de phase I ont notamment été conduits avec succès à partir d'oligonucléotides antisens qui empêchent la production de la protéine. De la même façon, des oligonucléotides antisens sont étudiés pour contrer la protéine mutante C9ORF72.

Le microenvironnement des neurones fait aussi l'objet d'études interventionnelles : une molécule expérimentale, le NP001, a fait l'objet de premières études cliniques pour contrer l'activité délétère des macrophages environnants.

Favoriser la régénérescence neuronale permettrait par ailleurs de pallier le mécanisme de mort cellulaire de la SLA. Des premières études cliniques sont en cours avec un agent anti-NOGO, ciblant la protéine NOGO, inhibitrice de la repousse des axones.

 

Thérapie cellulaire et cellules souches
La thérapie cellulaire consiste à restaurer la fonction d’un tissu ou d’un organe en introduisant des cellules saines dans l'organe malade. Deux options sont envisagées afin d'appliquer cette approche innovante à la problématique de la SLA : la première consiste à remplacer les cellules défaillantes de l'environnement des motoneurones afin qu'elles leurs apportent des facteurs trophiques favorables à la survie de ces derniers. Pour l'heure, les chercheurs utilisent différents types de cellules issues de la moelle osseuse ou des cellules souches issues du tissu nerveux, qui sont injectées dans la moelle épinière. Plusieurs études cliniques ont d'ores et déjà été conduites en Espagne, en Israël et aux Etats-Unis. 
A plus long terme, une seconde option pourrait consister à utiliser des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), spécialisées en motoneurones ou en cellules de soutien avant d'être administrées. Ces cellules thérapeutiques viendraient remplacer les motoneurones défaillants ou les cellules de leur environnement. Beaucoup d’étapes restent encore à franchir pour y parvenir.
Mais quelle que soit l'option, la difficulté de mise en œuvre de la thérapie cellulaire est d'apporter les cellules de remplacement in situ. Cela nécessite une chirurgie lourde qui pourrait être limitante pour l’utilisation clinique de ces approches.

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ACTUALITÉ

Des cellules iPS bientôt testées chez l'homme

actualité - par Rafaële Brillaud dans mensuel n°479 daté août 2013 à la page 8 (1276 mots) | Gratuit
C'est une première mondiale qui, en ce mois de septembre 2013, débute chez des patients souffrant d'une dégénérescence de la rétine. Le 19 juillet, le ministère japonais de la Santé a autorisé un essai clinique recourant à des cellules jamais utilisées auparavant chez l'homme : des « cellules souches pluripotentes induites », ou cellules iPS. Ces cellules se distinguent par leurs propriétés et leur origine. En effet, elles peuvent donner, à volonté, tous les types de cellules du corps humain, comme le feraient des cellules souches embryonnaires. Mais contrairement à celles-ci, elles ne proviennent pas d'un embryon : on les obtient en « reprogrammant » des cellules différenciées prélevées chez un adulte.

La mise au point, en 2007, des premières cellules iPS humaines avait valu dès 2012 le prix Nobel de médecine au biologiste Shinya Yamanaka, de l'université de Kyoto. Depuis, les cellules iPS sont devenues une priorité de recherche au Japon, avec d'importants financements alloués par l'État. En cet été 2013, c'est l'ophtamologiste Masayo Takahashi, responsable de l'équipe « régénération de la rétine », de l'institut Riken, à Kobe, qui se retrouve sous les feux de la rampe.

En collaboration avec un centre hospitalier de cette ville, elle utilisera des cellules iPS pour soigner des patients souffrant de dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Cette maladie, qui conduit à une perte progressive de la vision, est la principale cause de cécité des plus de 55 ans dans les pays industrialisés. L'essai japonais vise à s'assurer de l'innocuité de ce type de thérapie - ou du moins, de l'absence de risques majeurs.

Choix des patients
Au Japon, la DMLA touche plus de 700 000 personnes, pour une population d'environ 127 millions d'habitants. « En France, plus d'un million de patients sont concernés, précise Olivier Goureau, de l'Institut de la vision, à Paris. L'incidence augmente avec l'âge : la DMLA concerne 10 % d'individus au-delà de 65 ans, 25 % au-delà de 75 ans, et 60 % au-delà de 90 ans. »

Cette pathologie affecte la zone centrale de la rétine, la macula, responsable de l'acuité visuelle et indispensable pour conduire ou lire. « Avec l'âge, pour des raisons encore mal connues, la couche externe de la rétine se dégrade, détaille Olivier Goureau. Or cette couche externe, nommée épithélium pigmentaire, est nécessaire au bon fonctionnement de la macula adjacente, qui contient les cellules photosensibles. » Lorsque l'épithélium dégénère, les cellules photosensibles aussi, d'où la dégradation de la vision centrale [1].

Pour préserver la vision, l'une des approches envisagées consiste à retirer chirurgicalement l'épithélium déficient et à le remplacer par un épithélium pigmentaire intact produit in vitro. L'objectif de cette « thérapie cellulaire » est d'enrayer la dégénérescence des photorécepteurs. Dans l'essai japonais, la couche d'épithélium pigmentaire sera produite à partir de cellules iPS. Un autre essai, aux États-Unis, fait quant à lui appel à des cellules souches embryonnaires (lire « Un essai clinique avec des cellules souches embryonnaires », p. 10).

Masayo Takahashi et ses collaborateurs du Riken mèneront leur étude sur six patients de plus de 50 ans atteints de la forme la plus grave de DMLA : la forme « humide », où la prolifération incontrôlée de vaisseaux sanguins sous la rétine finit par l'endommager. Il s'agira de patients malvoyants n'ayant pas réagi aux traitements actuels visant à enrayer la prolifération des vaisseaux.

Le recrutement de ces patients a débuté dès le 1er août dernier, mais les transplantations d'épithélium pigmentaire rétinien ne seront pas effectuées avant l'été 2014. Pourquoi ce délai ? Parce que les cellules iPS seront obtenues à partir de cellules de peau prélevées chez chacun des patients. Cela présente l'avantage d'assurer une parfaite compatibilité immunologique des cellules iPS, et donc des cellules d'épithélium rétinien, avec la personne greffée. Mais cela prend du temps, car le rendement de la reprogrammation des cellules de peau en cellules iPS est assez faible. Autre étape chronophage : l'obtention, à partir des cellules iPS, de cellules épithéliales rétiniennes en quantité suffisante.

Heureusement, l'oeil humain est un petit organe, qui ne nécessite donc pas beaucoup de cellules. De plus, « celles de l'épithélium pigmentaire rétinien sont relativement faciles à obtenir à partir de cellules iPS, précise Olivier Goureau. C'est d'ailleurs l'équipe de Masayo Takahashi qui y est parvenue pour la première fois il y a deux ans ». Mais même dans ce contexte plutôt favorable, l'ensemble de ces deux étapes devrait prendre dix mois environ.

Évaluation des risques
À l'avenir, lorsqu'un grand nombre de patients seront concernés, cette approche très personnalisée devrait être remplacée par le recours à des banques de cellules abritant des lignées de cellules iPS immunologiquement compatibles avec la plus grande partie de la population. Des banques, telles celle que Shinya Yamanaka est en train de constituer à Kyoto : d'ici 2020, elle renfermera 75 lignées de cellules iPS immunologiquement compatibles avec 80 % de la population japonaise.

En attendant, des essais comme celui mené par Masayo Takahashi permettront de vérifier que ce type de thérapie ne fait pas courir de risque particulier aux patients. Car si les cellules iPS, par leur origine « adulte », affranchissent les chercheurs des contraintes éthiques afférentes aux cellules souches issues d'embryons, elles ne sont pas exemptes de défauts. « Elles demeurent des cellules manipulées », souligne Christelle Monville, de l'Institut des cellules souches pour le traitement et l'étude des maladies monogéniques, à Évry. Il est ainsi difficile de prévoir leur devenir une fois greffées à un organisme humain, tant qu'aucune expérience n'aura été faite.

Dès leur découverte, les cellules iPS présentaient un fort risque cancérigène lié à leur fabrication. En effet, la reprogrammation des cellules adultes s'effectuait initialement en leur injectant 4 gènes par le biais de virus. Cela entraînait l'insertion au hasard de ces gènes dans le génome des cellules, ce qui faisait courir le risque d'activer ou d'inactiver d'autres gènes de manière imprévue [2].

Évolutions techniques
« Les techniques ont heureusement beaucoup évolué, précise Christelle Monville. Par exemple, on peut utiliser de petites molécules d'ADN appelées épisomes, grâce auxquelles les gènes injectés s'expriment et reprogramment la cellule, mais sans s'insérer dans le génome. » De plus, les tissus rétiniens obtenus à partir des cellules iPS subiront toute une série de vérifications pour vérifier l'absence de mutations cancérogènes et d'infection virale.

« Néanmoins le risque zéro n'existe pas, reconnaît Christelle Monville, qui pointe trois types de risques différents. Le développement d'une tumeur est a priori écarté par les études précliniques, mais il est toujours possible qu'une cellule pluripotente résiduelle se mette à proliférer. Une cellule greffée peut aussi s'échapper et se trouver dans un autre organe, où elle va former une tumeur ou bien tout simplement ne pas avoir la bonne fonction. Le risque est cependant minime car la cellule a de fortes chances d'être éliminée si elle se retrouve dans d'autres tissus. Enfin, comme pour toute greffe, les cellules greffées peuvent ne pas survivre ou ne pas fonctionner correctement. »

Le choix de l'oeil pour ce premier essai clinique n'est pas anodin : il permet justement de pondérer tous ces risques. Cet organe est peu susceptible de développer une tumeur et il est aisément accessible si une intervention s'impose.

Néanmoins, ces essais cliniques avec cellules iPS n'arrivent-ils pas trop vite ? C'est ce qu'a longtemps pensé Christelle Monville, avant de visiter le laboratoire de Masayo Takahashi au printemps dernier. « Les effets d'annonce et l'absence de publication des études précliniques nous faisaient penser qu'il y avait précipitation. Cela nous a beaucoup rassurés de les rencontrer. L'équipe aborde vraiment les problèmes un par un, prend le temps de valider toutes les étapes pour être dans de bonnes conditions cliniques. Elle veut réussir, mais pas à tout prix. Leur démarche est la bonne. Je n'en connais pas d'autres aussi avancées et prêtes à aboutir. »

Par Rafaële Brillaud

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NEURONES À VOLONTÉ
Parkinson : l'efficacité des greffes thérapeutiques ?

neurones à volonté - par Philippe Damier et Philippe Brachet dans mensuel n°329 daté mars 2000 à la page 38 (2529 mots) | Gratuit
Alors que l'utilisation de cellules souches modifiées génétiquement en est encore au stade préclinique et que les greffes de neurones embryonnaires ont montré leur efficacité mais restent difficilement applicables, des techniques alternatives existent. Pourtant, retarder le développement de la maladie reste un objectif hors d'atteinte.

Caractérisées par la détérioration lente et irréversible de groupes particuliers de cellules nerveuses, puis leur mort, les maladies neurodégénératives sont rapidement invalidantes. Aucun traitement ne parvient aujourd'hui à enrayer leur développement, et leur incidence croissante en fait un des enjeux majeurs de la santé publique dans les pays occidentaux. Les deux plus fréquentes d'entre elles sont la maladie d'Alzheimer et la maladie de ParkinsonI. Dans la première, les cellules nerveuses détruites sont plus particulièrement impliquées dans les capacités mnésiques et langagières. La seconde, sur laquelle nous concentrerons notre attention, est associée à la perte de cellules essentielles au contrôle de la motricité. A défaut d'un traitement capable de stopper ou au moins de ralentir le processus dégénératif, les progrès réalisés ces dernières années ont permis la mise au point de traitements correctifs.

C'est sans doute la relative simplicité des lésions nerveuses impliquées dans la maladie de Parkinson qui explique les succès eux aussi relatifs que l'on peut observer dans son traitement. En effet, la maladie est causée par la destruction quasi exclusive d'un groupe de 500 000 neurones seulement sur plusieurs milliards que compte le cerveau. Confiné dans une petite structure appelée substance noire, le corps de ces neurones a pour particularité de produire un neurotransmetteur : la dopamine. La molécule est acheminée au travers du prolongement des cellules les axones vers leurs cibles, essentiellement les neurones d'un noyau de taille supérieure, le striatum voir schéma p. 40. La mort des neurones de la substance noire amène donc un déficit en dopamine dans le striatum. Celui-ci, à son tour, est responsable des troubles moteurs observés chez les malades : tremblement caractéristique au repos, difficultés à initier les gestes ou ralentissement dans l'exécution des mouvements, rigidité1.

Le rôle du déficit en dopamine dans la symptomatologie parkinsonienne fut découvert au début des années 1960 par O. Hornickiewicz et W. Birkmayer à l'université de Vienne. Dès 1967, G. Cotzias eut l'idée, non pas d'administrer directement de la dopamine, car elle ne pénètre pas dans le cerveau, mais son précurseur immédiat : la L-dopa. Celle-ci peut entrer dans le système nerveux central et y être transformée en dopamine. L'effet thérapeutique fut spectaculaire. Des patients grabataires devinrent à nouveau capables de se mouvoir presque normalement2. Cette formidable épopée thérapeutique a été illustrée, en 1992, par le film L'Eveil avec Robert De Niro. Néanmoins, les modalités de libération de la dopamine sont probablement très différentes des conditions physiologiques, et en particulier, indépendantes de l'activité motrice du patient. Après quelques années de traitement, les symptômes réapparaissent en dépit d'une augmentation des doses prescrites, et surtout un phénomène encore mystérieux se développe souvent, la survenue de mouvements involontaires. Dans les périodes où les symptômes parkinsoniens sont corrigés par le traitement, se greffent à la motricité du patient des mouvements anormaux touchant les membres, le tronc, le visage - des sortes de tics sévères - qui peuvent être tout aussi gênants que l'état parkinsonien. Le patient oscille donc entre des états où sa motricité est réduite état parkinsonien et des états où elle est perturbée par des mouvements anormaux involontaires, sans pratiquement plus connaître d'état avec une motricité normale3. Ces difficultés expliquent que les médecins aient recherché de nouvelles voies de traitement.

Une thérapeutique a priori séduisante serait de réimplanter dans le cerveau les cellules détruites par le processus dégénératif. C'est l'objectif des greffes neuronales. Il est néanmoins difficilement envisageable de greffer des cellules fabriquant de la dopamine directement dans la substance noire où elles sont normalement situées. En effet, cette région est d'un accès chirurgical délicat. Surtout, il serait indispensable que les cellules greffées soient capables de former des prolongements neuronaux jusqu'à leur tissu cible. Cette migration des prolongements neuronaux, qui a lieu au cours de la vie embryonnaire, est complexe. Chez l'adulte, nous ne disposons aujourd'hui d'aucun moyen de l'obtenir de façon satisfaisante. C'est la raison pour laquelle les cellules fabriquant de la dopamine sont greffées directement au niveau de leur cible, le striatumII.

Dans une première étape, l'idée a été de greffer au patient des cellules lui appartenant et produisant également de la dopamine, celles issues de sa glande médullosurrénale au-dessus des reins. Cette autogreffe avait le double avantage de ne poser aucun problème de rejet et de profiter de l'équipement enzymatique déjà présent dans les cellules de cette glande pour fabriquer la dopamine. La faible efficacité thérapeutique et surtout la survenue d'un grand nombre de complications chirurgicales conduisirent rapidement à l'abandon de cette technique. Un patient atteint de maladie de Parkinson supportait en effet difficilement une double intervention chirurgicale, abdominale pour prélever du tissu de la glande surrénale, cérébrale pour la mise en place de la greffe.

Où trouver d'autres cellules productrices de dopamine ? Dans une deuxième étape, le choix du greffon s'est orienté vers les cellules nerveuses embryonnaires4. En prélevant chez un embryon des cellules situées dans la partie haute du tronc cérébral à un stade précis de son développement six à neuf semaines de grossesse, il est possible d'obtenir des cellules capables de fabriquer le neurotransmetteur recherché. Ces cellules sont issues du matériel tissulaire d'interruptions volontaires de grossesse, la patiente ayant donné son accord pour une utilisation scientifique de l'embryon. Les fragments tissulaires ainsi obtenus sont implantés en différents endroits entre quatre et six du striatum du malade.

L'implantation de la greffe fait appel à la neurochirurgie stéréotaxique. Cette technique permet d'atteindre une structure à l'intérieur du cerveau au travers d'un trou de trépan de seulement quelques millimètres de diamètre, donc sans avoir à ouvrir la boîte crânienne. Un système de repérage externe cadre de stéréotaxie est rendu solidaire du crâne du patient : le premier est vissé au second. Les repères anatomiques intra-cérébraux et les éléments du système de repérage externe sont ensuite visualisés conjointement par imagerie cérébrale imagerie par résonance nucléaire par exemple. La localisation d'un grand nombre de structures, en particulier le striatum, peut être déterminée à partir d'atlas anatomiques et des repères anatomiques intracérébraux visualisés. Cette localisation peut alors être définie par rapport aux repères du cadre de stéréotaxie. Il est ainsi possible d'atteindre le striatum avec une canule et d'y implanter le tissu à greffer, avec une précision de l'ordre du millimètre. L'intervention peut concerner un seul ou les deux hémisphères cérébraux. Un traitement immunosuppresseur est généralement donné pendant quelques semaines pour éviter le rejet du greffon.

Les premiers patients ont été opérés il y a huit ans cinq ans seulement dans le cas des interventions bilatérales. A ce jour plus de trois cents malades ont bénéficié du traitement dans le monde dont dix en France, à l'hôpital Henri-Mondor à Créteil. Avec le recul, on peut dire aujourd'hui qu'il est bien démontré que les greffes améliorent significativement la situation clinique des patients, en particulier lorsque l'implantation est bilatérale. Cette amélioration persiste voire progresse à distance de l'intervention, en particulier avec une réduction progressive des doses de médicaments antiparkinsoniens dont les patients ont besoin pour corriger les troubles résiduels. Des techniques d'imagerie cérébrale comme la tomographie à émission de positons TEP ont permis de confirmer l'augmentation des capacités de stockage de L-dopa dans le striatum des patients greffés, confortant l'idée que les cellules nerveuses greffées étaient viables et fonctionnelles5. Enfin, chez deux patients greffés, décédés dix-huit mois après l'opération pour des raisons indépendantes de celle-ci, l'analyse post-mortem a montré que les cellules greffées s'étaient parfaitement intégrées au tissu cible et restaient capables de produire de la dopamine6. Quant au risque opératoire, représenté principalement par des accidents hémorragiques ou des infections, il est relativement faible inférieur à 3 % mais il faut y ajouter les risques liés à l'utilisation d'un traitement immunosuppresseur7.

Cependant, de nombreux problèmes demeurent. Il est encore très difficile de contrôler précisément le nombre de cellules fabriquant de la dopamine apportées au cerveau du patient. L'intégration de ces cellules au tissu hôte reste faible et mal contrôlée, en particulier le type de connexions que ces cellules effectuent avec les cellules nerveuses du striatum. Une amélioration de ces deux facteurs est envisageable, mais la principale difficulté est d'un autre ordre. Il faut entre deux et sept embryons prélevés dans des conditions précises pour greffer d'un seul côté un patient atteint de maladie de Parkinson. Les problèmes éthiques liés à l'utilisation de tissus embryonnaires humains rendent difficilement concevables des interventions de ce type à grande échelle.

Des méthodes alternatives sont donc à l'étude. La première est la greffe de cellules nerveuses d'origine animale, et en particulier d'origine porcine. Les quantités de tissu disponibles deviennent alors illimitées. Se posent néanmoins des problèmes de risque infectieux virus latents chez le porc devenant pathogènes une fois présents dans le cerveau humain et surtout celui du rejet de la greffeIII. Le premier essai thérapeutique, tenté aux Etats-Unis a donné des résultats décevants. Cette absence d'efficacité thérapeutique s'explique probablement par la destruction d'une grande partie du greffon par des manifestations de rejet immunitaire. Des recherches sont en cours pour améliorer cet aspect. Il pourrait en particulier être possible de transformer génétiquement les animaux donneurs pour rendre leur tissu plus tolérable sur le plan immunologique chez un être humain.

Une autre possibilité consiste en l'utilisation de lignées cellulaires cultivées in vitro et fabriquant de la dopamine, comme des cellules issues de tumeurs de glandes surrénales de telles cellules se multiplient indéfiniment : elles sont « immortelles ». Implanter de telles cellules risquerait d'entraîner le développement d'une tumeur cérébrale, et son application directe en thérapeutique humaine est donc exclue. Pour pallier ce risque, il a été proposé d'enfermer les cellules dans des capsules perméables exclusivement aux petites molécules, dont les neurotransmetteurs. Un tel système constitue une véritable « mini-pompe » biologique capable d'administrer la dopamine directement à l'intérieur du cerveau. Les résultats de l'application de cette technique dans le cas de la maladie de Parkinson ne sont pas encore connus.

Plus prometteuses sont en fait les thérapies visant à transformer par génie génétique des cellules pour les rendre capables de fabriquer de la dopamine. La première option est l'utilisation de certaines cellules non neuronales du patient, comme les fibroblastes présents dans la plupart des tissus de l'organisme, chez lesquels est introduit le gène de l'enzyme permettant la synthèse de la dopamine. La seconde option repose sur l'utilisation de précurseurs de neurones, les cellules souches neuronales. Il semble possible de les transformer en cellules dopaminergiques via une combinaison complexe de facteurs de croissance. Les cellules souches peuvent être obtenues dans du tissu embryonnaire mais aussi dans certaines régions du cerveau adulte voir l'article d'Alfonso Represa , p. 35. Il devient possible de les cultiver en laboratoire pour en obtenir un nombre important8. Ces résultats laissent penser que d' importants stocks de cellules souches humaines, capables de se différencier vers un type neuronal adulte fonctionnel une cellule fabriquant de la dopamine par exemple seront un jour disponibles pour des greffes. Mais ces techniques en sont encore au stade de l'expérimentation préclinique. Une des grandes incertitudes est liée au devenir à long terme de telles cellules dans le système nerveux, à leur capacité de survie. Une dernière option de thérapie génique consiste à injecter dans le cerveau des virus dans lesquels le gène de l'enzyme de synthèse de la dopamine a été introduit. Ces virus peuvent alors infecter des cellules nerveuses, leur apporter le nouveau gène et les rendre ainsi capables de fabriquer de la dopamine. Là aussi la survie prolongée des cellules nerveuses infectées reste problématique. Surtout il existe un risque que ces virus se transforment en des agents pathogènes pour le système nerveux.

Par ailleurs, ces quinze dernières années ont vu d'importants progrès dans la connaissance du fonctionnement de l'ensemble des structures cérébrales impliquées dans la maladie appelées noyaux gris centraux. En particulier, il est désormais démontré que l'absence de dopamine striatale, dans la maladie de Parkinson, entraîne une hyperactivité neuronale dans des noyaux cérébraux dépendants du striatum, comme le noyau subthalamique ou le globus pallidus interne9. L'idée a ainsi germé de corriger les dysfonctionnements neuronaux provoqués par le déficit en dopamine en agissant directement au niveau de leurs conséquences. C'est à une équipe française, dirigée par les professeurs Alim-Louis Benabid et Pierre Pollak, à Grenoble, que l'on doit la mise en évidence, depuis 1994, de l'intérêt de la stimulation électrique de ces noyaux hyperactifs pour le traitement de la maladie. La technique consiste en l'implantation, par neurochirurgie stéréotaxique, d'électrodes dans les noyaux hyperactifs le plus souvent une électrode dans chacun des deux noyaux subthalamiques. Ces électrodes sont ensuite reliées par un câble sous-cutané à un générateur d'impulsions électriques implanté sous la clavicule. Le générateur semblable à un pacemaker délivre un courant électrique à haute fréquence aux noyaux cibles, corrigeant ainsi leur dysfonctionnement et améliorant de façon spectaculaire l'état clinique des patients. Le mécanisme exact de l'effet de la stimulation à haute fréquence est encore inconnu, mais tout se passe comme si cette activité électrique imposée au noyau l'inactivait. L'amélioration est telle que les patients peuvent réduire de plus de 50 % leur traitement médicamenteux, certains patients pouvant même totalement s'en passer. Le bénéfice obtenu est souvent exceptionnel, avec des patients passant d'un état grabataire à un état compatible avec une reprise d'activité professionnelle ou sociale normale10. De plus, cette technique possède l'avantage d'une totale réversibilité qui rend plus sûre son utilisation. Si la stimulation entraîne des effets indésirables majeurs, il est ainsi possible d'arrêter le générateur mais au prix de la réapparition de la totalité des signes cliniques du patient. En fait, la possibilité de régler très précisément les différents paramètres de stimulation fréquence, voltage, forme du signal électrique par télémétrie permet d'obtenir une efficacité maximale sur les signes parkinsoniens sans générer d'effets indésirables. Les résultats thérapeutiques sont immédiats et nettement supérieurs à ceux apportés par les greffes de cellules nerveuses embryonnaires. Ces résultats se maintiennent avec le temps, le recul depuis la première intervention étant de cinq ans. Comme dans le cas de la chirurgie des greffes, le risque opératoire est faible. La principale limite actuelle de cette technique est son coût, de l'ordre de 100 000 francs de matériel par patient.

Dans le cadre plus général des maladies neurodégénératives, la technique de la stimulation électrique, malgré la puissance du bénéfice thérapeutique obtenue, n'est utilisable que dans un petit nombre d'affections dans lesquelles les lésions neuronales entraînent des dysfonctionnements localisés. Outre la maladie de Parkinson, cela ne concerne que certains tremblements ou des rigidités musculaires diffuses dystonies généralisées. Les véritables avancées proviendront donc surtout de l'identification de la cause de ces maladies ou au moins des mécanismes à l'origine de la destruction des neurones. Seules celles-ci permettront d'envisager des traitements réellement curatifs. Sans connaître la cause exacte, une action sur le processus dégénératif est néanmoins envisageable. On a vu qu'il était possible de transformer des cellules souches pour leur faire produire de la dopamine avant de les greffer. De même, on devrait pouvoir apporter au cerveau atteint d'une maladie dégénérative des facteurs arrêtant ou ralentissant le processus de destruction cellulaire les facteurs neurotrophiques. Malgré des travaux expérimentaux encourageants, les résultats des premières études cliniques restent encore modestes.

Par Philippe Damier et Philippe Brachet

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